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离心机厂家:离心操作及离心机的使用

文章来源:lixinji 人气: 107 发表时间: 03-20

在实验中如何收集样品,使样品聚集或分离?今天就向大家介绍离心操作。

离心技术

离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力,使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮,从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。离心技术是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一,也是生化实验室中常用的分离、纯化或澄清的方法。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时,当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时,颗粒离开轴心方向移动,发生沉降;如果颗粒密度低于周围介质的密度时,则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。

离心原理

将样品放入离心机转头的离心管内,离心机驱动时,样品液就随离心管做匀速圆周运动,于是就产生了一向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同,在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同,由此便可以得到相互间的分离。

离心力

溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个向外离心力,其定义为:

F = mω2r

式中:

F 为离心力的强度; m 为沉降颗粒的有效质量;

ω 为离心转子转动的角速度,其单位为rad/s;

r 为离心半径(cm),即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。

很显然,离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大,而随着离心半径的减小而降低。离心力通常以相对离心力Fcf 表示,即离心力F 的大小相对于地球引力(G)的多少倍,单位为g,其计算公式如下:

Fcf = 1.119×105(h)2r×g

可以看出,在同一转速下,由于f 的不同,Fcf相差会很大,实际应用时一般取平均值。在离心实验的报告中,Fcf、r 平均、离心时间t 和液相介质等条件都应表示出来,因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系。显然Fcf是一个只与离心机相关的参数,而与样品并无直接的关系。

速度与系数

一个颗粒要沉降,它必须置换出位于它下方等体积的溶液,这只有当颗粒的质量大于被置换出的液体的质量时才能通过离心的手段达到,否则,在离心过程中颗粒将发生向上漂浮,而不是下沉。当颗粒在运动时,不论方向如何,它都要穿过溶剂分子,所产生的摩擦力总是与颗粒运动的方向相反。

摩擦力的大小与颗粒的运动速度成正比,并且受颗粒的大小、形状及介质性质的影响:式中:

f为颗粒在济剂中的摩擦系数.与颗粒的大小、形状及介质性质相关;

v为颗粒的沉降速度。

由于离心力的存在,颗粒将加速运动直到摩擦力与离心力相等。在这种情况下,颗粒所受到的净作用力为零,颗粒将以最大速度运动。

式中 Mp 和M s 分别为颗粒的质量及等体积的溶剂的质量。

上式中的Mp 和M s 很难确定,为了建立分子大小与沉降系数之间的关系,引入了沉降系数这一新的概念。沉降系数定义为沉降速度与离心力的比率或单位离心场中颗粒的沉降速度,它以svedberg单位计算,1S=1×10-13 s.例如,核糖核酸酶A 的沉降系数为1.85×10-13 s,即可记作1.85S.

近年来,在生物化学、分子生物学及生物工程等书刊文献中,对于某些大分子化合物,当它们的详细结构和分子量不很清楚时,常常用沉降系数这个概念去描述它们的大小。如核糖体RNA(rRNA)有30s亚基和50s亚基,这里的s就是沉降系数,现在多地用于生物大分子的分类,特别是核酸。

离心力与转速的换算

转速与离心力换算公式:

Rcf=1.118×(10-5)×r×[rpm]2

Rcf为离心力,一般以g(重力加速度)的倍数来表示;

rpm为转速,单位为转/分

r为半径,单位为厘米。

离心分离应用

离心分离是通过离心机的高速运转,使离心加速度超过重力加速度的成百上千倍,而使沉降速度增加,以加速液体中杂质沉淀并除去的一种方法。其原理是利用混合液密度差来分离料液,比较适合于分离含难于沉降过滤的细微粒或絮状物的悬浮液。

沉淀离心法

沉淀离心是分离悬浊液中的溶液和不溶性颗粒时,对样品进行简单、快速的离心分离,以代替耗时的过滤操作。

沉淀离心通常使用固定的转速(即离心力),离心一定时间以达到分离的目的。沉淀离心中离心机转速、转子半径及离心时间是决定分离效果的主要因素。离心沉淀样品所需时间取决于样品的沉降系数(s值),沉降系数s的物理学意义是单位离心力作用下样品的沉降速度。故沉降系数s越大,颗粒沉降越快,所需时间越短,反之亦然。

沉淀离心法是从悬浊液或乳浊液中分离样品最常用的一种方法,主要用于去除溶液中悬浮的杂质,或通过离心沉淀收集悬浮于溶液中的颗粒物质。

差速离心法

差速离心是根据颗粒大小和密度不同造成沉降速度(即沉降系数)的差异,通过分级提高离心转速或高速与低速离心交替进行,使具有不同质量的颗粒样品(或大分子)从混合液中分批沉降至管底,从而实现分离目的。

该方法适用于混合样品中各沉降系数差别较大的组分之间的分离,更准确地说是沉降系数差别在1至几个数量级的混合样品的分离,差别越大,分离效果越好。

差速离心法一般采用固定角转子,通过较低速度的离心沉淀,最重的颗粒将全部沉到管底。继续将上清液以更高的转速沉淀,即可得到次重的颗粒样品。逐步增加离心转速,即可分别得到不同重量的样品颗粒,以达到分离的目的。但以上只是理想状态,通常每步得到的沉淀并不均一,通常会混有较轻的颗粒。这是因为在离心前各种重量的颗粒均匀分布在溶液中,当开始离心后,所有颗粒都依照自身的沉降速度向管底移动,所以距离管底较近的轻颗粒也会沉到管底而混合到重颗粒之中。通常为了得到较纯的颗粒样品,还需要将沉淀重悬,用相同的转速再次沉淀。重复几次之后即可得到大小基本均一的颗粒。但是一般在实际使用中,差速离心通常不用于精细分离。仅用于s值相差1个数量级及以上的2种颗粒的分离,且沉淀不能实现完全回收。

差速离心技术的应用十分普遍,尤其是针对有生物活性的物质,如动植物病毒、各种亚细胞组分(细胞核、叶绿体、线粒体等),以及核酸和蛋白质等生物大分子的分离、粗提和浓缩。

梯度离心法

密度梯度离心法是使待分离样品在密度梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,最终分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法,又称区带离心。

密度梯度离心不仅可依据样品颗粒的重量及沉降系数进行分离,还可根据样品颗粒的密度、形状等特征进行分离。密度梯度离心在整个离心过程中只使用一种转速,中途无需变更实验参数,而差速离心则需要进行调整转速、重悬反复离心等操作。密度梯度离心适宜分离密度有一定差异的样品,而差速离心则适用于分离混合样品中各沉降系数差别较大的组分。

密度梯度离心的优点是:分离效果好,可一次性获得较纯的样品颗粒;适应范围广,既可像差速离心法一样分离具有沉降系数差异的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒;颗粒会悬浮在相应的位置上形成区带,而不会形成沉淀被挤压变形,故能最大限度保持样品的生物活性;样品处理量大,且可同时处理多个样品;对温度变化及加减速引起的扰动不敏感。密度梯度离心法的缺点是:离心时间长、需制备密度梯度介质溶液、对操作者的技能要求较高。密度梯度离心法通常采用吊桶式的水平转子、区带转子及近垂直转子。

离心前,离心管内先装入分离介质(如蔗糖、甘油等),使形成连续的或不连续的密度梯度介质,然后加入样品进行离心,具体又可分为:

速度区带

离心前,离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质,待分离样品铺在梯度液的顶部,离心管底部或梯度层中间,同梯度液一起离心,利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同,使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内,达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。

预制梯度

要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质,常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等,待分离样品一般铺在梯度液顶上,如需挟在梯度液中间或管底部,则需调节样品液密度。离心后,不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层,即达到等密度的位置而获得分离。

自成梯度

某些密度介质经过离心后会自成梯度,例Percoll,可迅速形成梯度,CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合,离心开始后,梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时,可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布,到达与其自身密度相等的梯度层里,即达到等密度的位置而获得分离。

离心工具—离心机

离心机是利用离心力,分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械。离心机主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开,或将乳浊液中两种密度不同,又互不相溶的液体分开;它也可用于排除湿固体中的液体;特殊的超速管式分离机还可分离不同密度的气体混合物;利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点,有的沉降离心机还可对固体颗粒按密度或粒度进行分级。

小型离心机

小型离心机一般不可调节离心转速和离心温度,打开开关即可离心,关闭开关即可停止离心(部分小型离心机为开盖自动离心,关盖自动停止离心),小型离心机一般为固定转速低速离心,离心转速一般为100~10000转/分,相对离心力可达0.1~10kg,根据小型离心机的转子不同可以离心0.2mL、0.5mL、1.5mL、2.0mL、0.2mL、0.2mL-8连排离心管和0.2mL-96孔反应板。

中型离心机

中型离心机一般可以调节离心转速,开始、结束离心和开盖通过按钮控制,不可调节离心温度,离心转速、离心时间和变速时加减速度通过操作面板进行调节,离心转速一般为100~15000转/分,相对离心力可达0.1~20kg,根据中型离心机的转子不同可以离心1.5mL、2.0mL和5mL离心管。

大型离心机

大型离心机一般可以调节离心转速和离心温度,开始、结束离心和开盖通过按钮控制,离心转速、离心时间、变速时加减速度和离心温度通过操作面板进行调节,离心温度调节范围为0℃~室温,离心转速一般为100~20000转/分,相对离心力可达0.1~30kg,根据中型离心机的转子不同可以离心1.5mL、2.0mL、5mL、15mL、50mL离心管和250mL锥形瓶。

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